Как указал Н. А. Наумов (1937), совокупность приемов выделения и культивирования грибов изменяется в довольно широких пределах в зависимости от цели исследования. Однако принципиальная схема опытов укладывается в одну систему. Прежде чем получить изучаемый гриб в чистой культуре, необходимо иметь спороносную ткань или мицелий, свободные от заражения эпифитной микрофлорой, которая иногда искажает картину, осложняет идентификацию и изоляцию из пораженных тканей.
Одним из наиболее простых методов получения мицелия или органов спороношения (в том числе и ряда облигатных паразитов) является применение так называемых влажных камер. Для их изготовления обычно используют чашки Петри или Коха. Дно чашек и внутреннюю поверхность крышек выстилают кругами фильтровальной бумаги соответствующего диаметра, стерилизуют при температуре 110°С в течение двух часов и увлажняют стерильной водой. Небольшие части исследуемых тканей в количестве 3—10 образцов после поверхностной стерилизации раскладывают на дно чашек непосредственно на фильтровальную бумагу равномерно по ее поверхности.
Поверхностную стерилизацию частей больных тканей можно проводить с применением пламени спиртовой горелки (фламирование), струей воды или специальными химическими веществами. Метод поверхностной стерилизации природного субстрата пригоден для древесины, корней, семян или плодов. Чем объемистее стерилизуемый объект, тем тщательнее и дольше можно его прогревать, не опасаясь за жизнеспособность мицелия, находящегося внутри тканей.
Иногда необходимо выделить патогенный гриб из полуразложившегося материала или топких частей растения (перитеции парши на опавших листьях и т. п.). В этом случае исследуемый объект помещают на мелкое сито и промывают несколько часов под струей воды.
В дальнейшем взятый для исследования материал дополнительно очищают и дезинфицируют с поверхности погружением в одно из следующих веществ: 96-или 50%-иый спирт на 2—3 мин; раствор сулемы (0,1%-ный) с экспозицией от нескольких секунд до трех минут; 0,5—1,0%-ный раствор марганцовокислого калия (до 20 мин); осветленный раствор хлорной извести (1%-ный); 0,1—1,0%-ный раствор бромной воды (па несколько секунд) или в растворы других дезинфекторов с последующей промывкой в стерильной воде. С этой же целью может быть использован раствор формалина 1:300 с последующим томлением объекта в сосуде с его парами от 30 мин до 2 ч.
Исследования грибов, развивающихся во влажных камерах, следует проводить непосредственно в чашках при малом увеличении микроскопа в проходящем или отраженном свете.
После появления спороношения или признаков развития мицелия его пересевают на агаровую питательную среду непосредственно в пробирку на косой агар или предварительно на агаровую среду, разлитую в чашки Петри. Облигатные паразиты выращивают на живых растениях или специальных средах.
Для дальнейшей работы очень важно провести очищение культуры. Это осуществляют штриховой разводкой, разведением в стерильной воде или с помощью пробирок.
1. Небольшое количество гриба берут на культуральную петлю и наносят штрихом на поверхность агара в чашки Петри. По мере продления штриха споры все более разделяются до тех пор, пока в итоге не получаются индивидуальные колонии, возникшие из нескольких или единичных спор.
2. Инокулюм спор помещают в пробирку со стерильной водой (10 мл), затем стерильной пипеткой переносят определенное количество суспензии (например, 1 мл) в пробирку с 9 мл стерильной воды. Свежая стерильная пипетка используется, чтобы смешать жидкость и перенести 1 мл ее в очередную пробирку, содержащую 9 мл стерильной воды. Разведение продолжают по мере потребности. Такое десятитысячное разведение имеет некоторые преимущества перед штриховой разводкой. В последнем разведении 1 мл споровой суспензии добавляют к расплавленному агару, охлажденному примерно до +40°С.
3. Берут пять пробирок соответствующей агаровой среды, расплавляют ее и охлаждают до +45°С. Затем в одну из пробирок вносят небольшое количество спор; пробирку прокручивают между ладонями и содержимое выливают в чашку Петри. Опорожненную пробирку снова наполняют из другой пробирки расплавленной средой, прокручивают между руками и выливают во вторую чашку. Эту процедуру повторяют с остальными тремя пробирками среды.
При проведении теоретических исследований или анализе популяции какой-либо географической формы возникает необходимость получения культуры из одной споры. Практически моноспоровую культуру многих грибов получают следующими способами.
1. Приготовляют слабую суспензию спор на стерильном предметном стекле в стерильной воде погружением обожженной увлажненной петли в спорулирующую культуру. Эту суспензию спор наносят штрихом вдоль намеченной линии в чашке Петри на очень тонкую пластинку агара, приготовленную на кипяченой воде, и выдерживают при +24°С. Если это сделано в 16—17 ч, то в 9—10 часов на следующий день обычно наблюдают начало прорастания и готовность спор для изоляции.
При работе с бинокуляром (стереоскопическим микроскопом) чашку Петри перемещают вдоль линии отметки и выбирают подходящие проросшие споры. Соответствующей иглой делают вырез ангара площадью около 2 мм вокруг споры. Этот квадрат и зону непосредственно вокруг него проверяют под малым увеличением биологического микроскопа, чтобы гарантировать наличие только одной споры.
Агаровый блок с проросшей спорой затем переносят при помощи стерильной иглы под бинокуляром в чашке с агаром или пробирку.
2. Питательную среду разливают тонким слоем в стерильные чашки Петри, затем берут пробирку со стерильной водой и в нее вносят небольшое количество спор исследуемого гриба и тщательно взбалтывают в воде. После этого металлической петлей берут 4—5 капель споровой суспензии и переносят на предметное стекло. Под микроскопом подсчитывают количество спор в каждой капле. Если капля заключает в среднем n спор, то в пробирку добавляют стерильную воду, чтобы объем ее увеличился в n+1 раз.
При этом можно полагать, что в одной капле будет в среднем по одной споре. После этого из пробирки с разбавленной суспензией спор берут 3—4 капли и переносят в чашки Петри на агаровую среду. Капли должны отстоять друг от друга на сравнительно большом расстоянии. Под микроскопом проверяют количество спор, попавшее в каждую из этих капель. Просмотр ведут с нижней стороны чашки, которую для этого осторожно переворачивают. При этом выбирают те из капель, в которых содержится по одной споре, и отмечают их на стекле восковым карандашом. Полученные в чашках Петри колонии отсеивают в пробирки на косой агар.
Иногда каплю суспензии, содержащую одну спору, помещают на стерильное стекло в чашку Петри и добавляют в нее кусочек агаровой среды; после обрастания его мицелием гриба культуру переносят в пробирку или чашку Петри.
3. Хансен (H. R. Hansen, 1926) использовал тонкие стеклянные капилляры, опускаемые с суспензией спор в теплую агаровую среду. Эти капилляры затем проверял микроскопически и разрезал на куски, в каждом из которых содержалось по одной споре. Такие куски затем подвергал поверхностной стерилизации и помещал в чашку с агаром.
Возможно использование и других методов получения моноспоровых культур, которые указаны в специальной литературе (например, метод «сухой иглы» Ханна и др.). Так, для получения моноспоровой культуры от уредоспор ржавчины хлебных злаков их стряхивают на сухое предметное стекло. Затем концом оттянутой стеклянной палочки отделяют одну спору под бинокуляром или при малом увеличении микроскопа. Конец палочки предварительно протирают ватой, смоченной денатуратом или спиртом. Выделенную спору переносят в капле воды на лист растений. Такие манипуляции проводят примерно 200 раз, имея в виду, что приживаемость обычно составляет 6—10%.
При выделении монопустульной культуры гриба предварительное размножение популяции ржавчины проводят так, чтобы на листьях образовались единичные уредопустулы. Для этого при инокуляции используют небольшое количество спор.
После получения первоначальных пустул в результате моноспоровой или монопустульной культуры гриба приступают к размножению спор в них на определенных сортах, повторяя процесс перезаражения растений хорошо развитыми уредопустулами 2—3 раза. В итоге накапливают достаточное количество инокулюма для последующей работы с ним.
Выделение чистых культур из различных органов и тканей имеет свои особенности. При поверхностных повреждениях плодов соскабливают внешний поврежденный слой и проращивают грибницу во влажной камере с последующим пересевом колонии на агаровую среду. Предварительно пораженную поверхность тщательно промывают стерильной водой.
При выделении культур из внутренних частей плода их тщательно промывают, дезинфицируют в сулеме (1:100) в течение 5 мин, после чего снова промывают в стерильной воде; вырезанные из внутренних тканей стерильным скальпелем кусочки плода раскладывают на питательный агар.
При выделении патогенов, вызывающих наружные повреждения корней, используют методику, описанную для плодов. При внутренних поражениях корни тщательно промывают, фламируют, после чего делают поперечные или продольные срезы. Полученные небольшие куски внутренних пораженных тканей проращивают на агаровой питательной среде.
Изоляция грибов из листьев, лепестков и других нежных органов связана с известными трудностями, так как в данном случае почти полностью приходится отказываться от поверхностной стерилизации при помощи химических веществ, которые могут оказать влияние на мицелий патогена, находящийся в мезофиле. Для повышения точности и достоверности работы по выделению следует использовать возможно более мелкие части тканей, увеличивая зато их общее количество.
Грибы, поражающие кору и древесину (трахеомикозы, гнили, некрозы), могут быть выделены непосредственно из пораженных тканей путем посева поверхностно простерилизованных кусков или срезов на питательные среды или из спор и мицелия, полученных во влажной камере. Древесина и кора должна быть свежими, поскольку в залежавшихся образцах развиваются плесневые грибы, засоряющие культуру.
Пораженную древесину дезинфицируют погружением на несколько минут в 95%-ный спирт или 0,5%-ный раствор марганцовокислого калия с последующим фламированием. Затем стерильным скальпелем или микротомом срезают поверхностные части образца, а из внутренних вырезают пластинки толщиной от нескольких микрон до 5—10 мм и переносят их на питательную среду.
При выделении культуры из плодовых тел гименомицетов вначале срезают поверхностный слой, а из внутренней части плодоносца вырезают небольшие куски — 4-5 мм в диаметре и погружают их наполовину в питательный агар. Затем развившуюся грибницу переносят на косой агар.
Для выделения эндогенной грибницы из молодых сеянцев пораженные части не стерилизуют, а только промывают, чтобы не убить ее; материал слегка расщепляют и помещают на питательный агар или во влажную камеру; появившийся мицелий быстро отделяют, стараясь не допустить разрастания сапрофитных микроорганизмов.
Более старые сеянцы дезинфицируют в 0,5%-ном растворе марганцовокислого калия, промывают водой и кладут во влажную камеру, откуда развившуюся грибницу переносят на питательную среду. Возможно также использование срезов стебля, которые раскладывают на агар для проращивания мицелия патогенных грибов.
Микрофлору больных семян обычно анализируют после развития ее в культуре на питательной среде (М М. Самуцевич, 1931). Для этого из партии семян из различных мест берут общую пробу, отсчитывают 200 семян и по 25 штук раскладывают в чашки Петри на агаровую среду.
При определении поверхностной инфекции семена не стерилизуют; для установления глубинного заражения их в течение 2—3 мин выдерживают в марганцовокислом калии (0,5%) или на 1 мин опускают в чистый спирт.
В некоторых случаях продезинфицированные семена разрезают на две части стерильным скальпелем. Сильно мумифицированные семена предварительно выдерживают на фильтровальной бумаге, увлажненной стерильной водой; после подсушивания и фламинирования помещают в чашки Петри. По мере появления спороношения патогенов их переносят на косой агар.
При выделении чистой культуры грибы предварительно выращивают на слегка подкисленных агаровых средах или желатине (Н. А. Наумов, 1937). Во время первоначальной изоляции патогена нельзя использовать жидкие или сильно увлажненные среды, так как это способствует развитию сапрофитных микробов. Не следует также сеять патогенные грибы на твёрдую питательную среду: рис, картофель, хлеб и другие продукты.
Для выявления патогенов, сохраняющихся в почве, с целью их последующей изоляции берут образцы с характерных почвенных разностей (подзол, чернозем, серозем и др.) на различной глубине из-под определенных культур и т. д. При взятии проб делают почвенный срез затем стерильным инструментом отделяют нужный слой, из которого и берут пробу в 10-20 г, помещая ее в стерильную посуду или конверт. Рекомендуется брать почву из верхнего стоя (до 3 см) и глубже, на уровне расположения основной массы корней. Для полной характеристики участка необходимо получить за три года сведения о предшествующих культурах и кислотности почвы (рН).
При изучении распределения инфекции в поле почвенные ямы вырывают через каждые 5 м на однородном участке; для рекогносцировочных обследований достаточно 5—10 почвенных ям на участок.
Собранную почву в течение нескольких дней высушивают до воздушно-сухого состояния в бумажных конвертах, измельчают и высевают на агаровую питательную среду с помощью стерильных шпателя, скальпеля и других инструментов. Каждую пробу (10—20 г) распределяют на 6—7 чашек Петри, затем выдерживают чашки в термостате при температуре 20—25°С и периодически просматривают. По мере развития колоний грибов их переносят на косой агар в пробирки. Наличие изолированных грибов определяют обычными способами. После 7—8 дней с момента начала роста колоний чашки становятся непригодными для отсева грибов в связи с загрязнением среды сапрофитными микроорганизмами.
Изучение почвенных грибов-микромицетов возможно путем выделения их в чистую культуру или с применением метода «пластинок обрастания», почвенных микрокамер, педоскопов, изготовленных из очень тонкого стекла, и других приемов.
Выделение микроорганизмов, в том числе и фитопатогенных грибов, в жизнеспособном состоянии из водной и воздушной сред — область специальных исследований. Существуют разнообразные методы анализов с применением отборников, автоматических объемных и инерционных спороловушек (Ф. Грегори, 1964; Ю. П. Бочков, А. И. Воронова, В. Ф. Думский, 1966; А. И. Клочко, 1969, и др.).
