Питательные среды и сохранение культур фитопатогенных возбудителей

Питательные среды и сохранение культур фитопатогенных возбудителей

Для получения чистых культур грибов — факультативных сапрофитов и факультативных паразитов, поддержания их жизнеспособности в целях дальнейшего изучения применяют различные питательные среды. Эти среды разграничивают на твердые и жидкие с известным и неизвестным химическим составом, естественные и искусственно приготовленные. Выбор того или иного типа питательного субстрата зависит от потребностей грибного организма и целей проводимого исследования. Например, при изучении иммунитета растений для оценки устойчивости растения-хозяина к токсическим веществам возбудителя болезни и влияния его выделения на рост патогенных форм необходимо получение обильного спороношения.

Специфические среды отбирают в процессе экспериментальных работ. Гриб высевают одновременно на разные среды в центре чашек Петри (в трех повторностях) и выдерживают при оптимальных для его развития температурах. Наблюдения проводят в течение 12-15 суток над ростом и развитием гриба (энергия роста, начало и характер спороношения, густота мицелия и т. п.), в результате выбирают наиболее подходящую среду. При использовании стандартных синтетических сред их состав можно изменять, добавляя и исключая различные химические компоненты.

Часто возникает необходимость изыскивать среды, па которых бы гриб рос и развивался лучше, чем в природе. Этого можно достичь благодаря тому, что после стерилизации в среде уничтожаются конкурирующие микроорганизмы, а составные вещества ее претерпевают глубокие биохимические изменения, способствующие лучшему усвоению некоторыми грибами. Обычно это агаровые среды с отваром или настоями (вытяжками) из растения-хозяина или стеблей донника. Так, па 1 л воды берут 100 г свежих или 50 г высушенных органов питающих гриб растений. Массу измельчают, кипятят один час, восстанавливают первоначальный объем жидкости, фильтруют, после чего добавляют 2-2,5% агар-агара, растворяют его и стерилизуют (М. К. Хохряков, 1969).

И. И. Миикевичем при выращивании грибов, паразитирующих на древесных растениях, были использованы естественные питательные среды, приготовленные по такому рецепту. Мелко нарезанные ветки определенных древесных пород (200 г) заливали водой (1 л) и выдерживали в течение 12 ч при 80°С, после чего настой фильтровали и добавляли агар-агар (2,5%). Затем среду стерилизовали два часа текучим паром в аппарате Коха. При специальных исследованиях из различных сортов приготавливали вытяжки, которые выравнивали по концентрации (1% по сухому веществу) путем последовательного разведения. Возможно применение подобных естественных сред и в более высокой концентрации.

Для определенных систематических групп патогенных грибов многими исследователями были подобраны естественные питательные субстраты и определены среды с известным химическим составом. Так, опытным путем установлено, что виды рода Fusarium хорошо произрастают на отварных зернах риса; грибы рода Piricularia развивают обильное спороношение на агаровой среде с отваром пшеничных зерен или корнеплодов моркови. Составы твердых питательных сред для отдельных видов и групп грибов приведены в таблице 20.

Приготавливая среды, надо иметь в виду следующие обстоятельства:

  1. грибы обычно растут лучше на среде, богатой углеводами, но выращивание их на таких средах длительное время может редуцировать споруляцшо;
  2. большинство грибов предпочитает слабокислую реакцию (рН 6,0-6,5), а бактерии — нейтральную (рН 7,0) или слабощелочную;
  3. углеводы и белки в кислых и щелочных растворах разрушаются при нагревании, поэтому они должны быть умеренно стерилизованы или добавлены отдельно;
  4. агар растворяют в половинной норме воды в течение 1-2 ч, а питательные вещества — в оставшейся воде, после чего компоненты смешивают;
  5. агар не затвердевает в очень кислых или щелочных средах;
  6. пептон в основном может быть исключен из состава сред, предназначаемых для грибов;
  7. кипяченую воду следует предпочесть дистиллированной, поскольку первая содержит полезные микроэлементы; для грибов рода Phytophthora лучше использовать дистиллированную воду;
  8. для сред, в состав которых входит растительный материал, из него предварительно делают вытяжку при низких (картофельный агар) или высоких (картофельно-декстрозный агар) температурах.

В ряде случаев (при изучении токсических выделений патогенов, ферментов и т. д.) употребляют жидкие питательные среды. Например, токсическое действие выделений Deuterophoma tracheiphila изучалось на среде, приготовленной ,настаиванием намельченных побегов растения-хозяина (200 г побегов на 100 см3 воды). Для головневых грибов рекомендована среда следующего состава: 0,03 г K2S04; 0,01 г NH4NO3; 10,0 г декстрозы (или мальтозы); 0,01 г CaCl2; 0,01 г Mga(Р04)2-4Н20 и воды 100 см3.

Для проведения различных исследований по биологии грибов и устойчивости растений возникает необходимость длительного хранения чистых культур. Однако после хранения ряд патогенных грибов изменяет морфологические и культуральные признаки, а иногда утрачивает патогенные свойства. Поэтому перед проведением опытов с грибами, взятыми после длительного хранения в чистой культуре, необходимо восстановить их патогенность, проводя , пассажи через растение-хозяина.

Состав питательных сред для выращивания фитопатогенных грибов

Название питательной среды Состав компонентов на 1 л воды, г Группа культивируемых грибов
Агаровая среда Агар-агар (15—20) Большинство видов (для получения спороношения) Phуtophthorа, Руtilium, Venturia, Monilia, Botrytis, Fusarium
Зерновой агар Кукуруза (30), агар-агар (20)
Картофельно-глюкозный агар Картофель (200), глюкоза (100), агар (20)
Картофельно-сахарозный агар 1000 мл картофельного экстракта (1800 г картофеля на 4500 мл воды), сахароза (40), агар (40)
Картофельно-декстрозный агар Картофель (200), декстроза (20—50), агар (20) Головневые
Картофельный агар Картофель (200), агар (20) Fusarium, Phytophthora
Мальц-пептонный агар Солодовый экстракт или мальц-экстракт (20), пептон (10), лимонная кислота (0,5), агар (20) Фитопатогенные и почвенные грибы, паразиты семян
Минеральный раствор Петри Нитрат кальция (0,40), сульфат магния (0,15), фосфат кислого калия (0,15), хлорид калия (0,06) Phytophthora (для получения спорангиев)
Овсяный агар Овес (100), агар (20) Clasterosporium, Fusarium
Синтетический агар Чапека Сульфат магния (0,5), безводный фосфат калия (1,0), хлорид калия (0,5), сульфат железа (0,01), нитрат натрия (2,0), декстроза (30), агар (20), вода дистиллированная Почвенные патогены и разрушители древесины
Среда Барнеса Фосфорнокислый калий (1), аммоний азотнокислый (1), азотнокислый калий (1), глюкоза (1), агар (20) Сумчатые (для получения плодовых тел)
Сусло-агар Неохмеленное 7%-ное пивное сусло (1000) вместо воды и агар (20) Большинство фито-патогенов

Широко распространенным способом поддержания чистых культур грибов служат периодические пересевы их на свежие питательные среды. Большинство культур пересевают 2-3 раза в год. При пересевах переносят главным образом споры, а у неспорообразующих форм —мицелий из краевой зоны колонии.

Пересевы делают в двух повторениях, а на хранение оставляют 3 экземпляра каждой грибной культуры, считая и пересев предыдущего срока. Один из новых пересевов используют только для будущего пересева, другой — для отсева при проведении экспериментальных работ.

Для длительного хранения грибов лучше использовать бедные сахарами крахмальные и целлюлозные среды. Ряд полусапрофитных грибов хорошо сохраняется на стерильном природном материале (например, грибы рода Cytospora па ветках растения-хозяина); при этом более всего подходит температура 4—5°С. Глубокое охлаждение (примерно около — 20°С) удовлетворительно сохраняет жизнеспособность грибов весьма продолжительный период.

Сохранять культуры грибов можно также под минеральным маслом, после лиофилизации (высушивание вымораживанием при пониженном давлении) и под жидким азотом в ампулах. Если грибы выдерживают полную обработку, то они будут жизнеспособны 10 лет и более. Однако использование этих методов требует громоздкой и дорогой аппаратуры.

В обычных условиях коллекцию грибов лучше всего содержать в широких пробирках на косой питательной среде, закрытых ватными пробками. Однако следует остерегаться порчи культур клещиками (виды родов Tyroglyphus и Tarsonemus), особенно в южных районах и летом в умеренном климате. Пробираясь в пробирку, колбы и чашки Петри, они поедают культуры, заражают их бактериями и загрязняют.

Имеются многочисленные способы борьбы с этими клещиками. Но прежде всего необходимо соблюдать общую гигиену, принимать меры к тому, чтобы в лабораторию не залетали насекомые, быть внимательным при работе с органическим материалом и с почвой. Весь новый материал при поступлении подлежит тщательной проверке. По возможности следует иметь отдельные комнаты для чистого и грязного материала.

Достаточно плотные ватные пробки обычно непроницаемы для клещиков, причем воздухоснабжение культуры не нарушается. Для большей гарантии пробки могут быть обработаны ядами, губительно действующими только на клещиков. Рекомендуется также использование папиросной бумага. В этих целях после закупорки ободок .ватной пробки обжигают в пламени горелки и покрывают его липким теплым желатином с сульфатом меди (сульфат меди — 20%, желатин — 20%, вода — 60%). Затем закрепляют это покрытие над концом пробирки папиросной бумагой. После подсыхания излишнюю бумагу обжигают. Такая бумага сочень тонкими порами препятствует проникновению клещиков, обеспечивая доступ воздуха. Таким же способом можно закупоривать колбы, но при этом резиновые пробки должны быть удалены, а папиросная бумага перед использованием простерилизована.

Полезно также все колбы, чашки и пробирки с зараженным материалом закрывать при получении бумагой.

Все культуры должны быть пронумерованы и зарегистрированы на специальных карточках, в которые записывают номер и название культуры, где и откуда она выделена, дату выделения, способ выделения, название сред, примененных при пересевах, результаты наблюдений за ростом патогена в чистой культуре и отмеченные при этом особенности.

Добавить комментарий

Войти с помощью: 

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *