Методы инокуляции растений

Прежде чем приступать к инокуляции растений, их следует подготовить. Они должны быть свободными от инфекций, заведомо здоровыми. Для этого подопытные растения лучше всего выращивать из здоровых семян в оранжерее или вегетационном домике в вазонах (цветочных горшках), заполненных свободной от инфекции почвой. Семена перед посевом обеззараживают обычными протравителями, а почву автоклавируют под давлением 1-2 атм.

При выращивании растения поливают, не увлажняя поверхности листьев и стеблей (воду льют непосредственно на почву или через специально вставленные трубки). По возможности исключают постороннюю или случайную инфекцию, переносимую насекомыми или через воздух.

Если подопытные растения в оранжерейном опыте получить из семян невозможно, то берут растения, произрастающие в диком состоянии, и пересаживают в горшки, после чего выдерживают в оранжерее в течение времени, равного минимум одному (желательно 1,5-2,0) инкубационному периоду болезни, причиняемой изучаемым грибом. Практически для этого вполне достаточно 7-10 суток.

При инокуляции растений грибами в полевых условиях необходимо намеченные надземные органы предварительно изолировать от окружающей среды остекленными деревянными каркасами, бумажными колпаками, полиэтиленовыми пакетами, стеклами от фонаря «летучая мышь» или ламповыми стеклами; последние привязывают к кольям, а верхнее и нижнее отверстия закрывают ватными тампонами. Такая предварительная изоляция на срок в 1-2 инкубационных периода необходима для того, чтобы убедиться в действительно здоровом состоянии подопытных органов растений. При этом во всех случаях стремятся к тому, чтобы изолированные растения или их органы развивались нормально, не были этиолированными, хлоротичными, подвядшими и т. д.

Возможно проведение опытов на срезанных частях растений, опущенных в воду, в питательный раствор, а также на отделенных листьях, помещенных в раствор бензимидазола.

Приемы инокуляции растений довольно разнообразны и зависят от биологии гриба и роли инфекции в патогенезе заболевания, а также от целей исследования (проверка патогенности штаммов, оценка устойчивости сортов и т. п.). Рассмотрим ряд приемов инокуляции, которые достаточно хорошо проверены и могут быть рекомендованы в практической работе.

Инокуляцию растений можно проводить как патогеном, выросшим на искусственной питательной среде, так и природной популяцией спор гриба. В зависимости от поставленной задачи используют различные инокулюмы —мицелий, споры, собранные с одного сорта растения-хозяина или представляющие географическую популяцию, и т. д.

При выборе метода инокуляции учитывают производительность труда, так как часто оценке подлежат тысячи сортов. Способы и сроки искусственного заражения по возможности приближают к естественным. Во всех случаях создают условия, оптимальные для роста патогена (температура, влажность). Количество инокулируемых растений должно быть не менее 10 с обязательным контролем.

Ряду заболеваний (пыльная головня пшеницы и ячменя, спорынья ржи, гельмиптоспориоз ячменя и овса, желтая ржавчина пшеницы и др,) свойственно проникновение инфекции через цветки и завязи. В данном случае инокуляцию осуществляют нанесением сухих спор или суспензии спор гриба в цветки и завязи. Например, М. К Хохряков (1969) указывает, что наиболее простой метод инокуляции пшеницы и ячменя пыльной головней заключается в распылении хламидоспор возбудителей болезни в период цветения злаков из марлевых мешочков или срезанных пораженных колосьев.

В. И. Кривченко (1963) модифицировал вакуумный метод инокуляции пшеницы возбудителем пыльной головни с помощью специального прибора, состоящего из цилиндра, в который помещают колосья, остающиеся на корню. Этот цилиндр имеет две выводных трубки, одна из которых соединена с насосами, а другая служит для подачи воздуха. Снизу, через специальную вакуумную зажимную пробку и шланг, подается суспензия спор (0,2 г спор на 0,5 л воды). Суть метода состоит в том, что по мере откачки из цилиндра с колосьями воздуха туда поступает вода со спорами. После подачи воздуха суспензия вытекает обратно в сосуд. Для получения достоверных данных достаточно заразить 6-10 колосьев одного сорта, а при оценке семей и линий гибридов-не менее трех колосьев.

Э. Э. Гешеле (1964) разделяет методы инокуляции пыльной головней на две группы: индивидуального заражения цветков и всего колоса. В первом случае ножницами срезают один верхний и два нижних колоска, а из остальных пинцетом удаляют средние цветки. После этого каждый цветок открывают и пинцетом вносят споры. Этот метод имеет ряд модификаций. В частности, заражать цветок можно с помощью специальной пипетки с грушей. Во втором случае на здоровый колос наносят материал, содержащий заразное начало головневых, предварительно сделав надрезы на уровне колоскового зубца.

Инокуляцию цветков ячменя осуществляют конидиями возбудителя полосатого гельминтоспориоза с помощью вакуум-прибора в период, когда колос еще не вышел из трубки, появились только кончики остей.

Цветки плодовых культур грибами рода Monilinia заражают, нанося сухие конидии увлажненным концом иглы на рыльце пестика. Затем цветки опрыскивают водой из пульверизатора и надевают на них смоченный в воде марлевый изолятор, который на сутки покрывают полиэтиленовой пленкой. В южных районах, кроме того, инокулированные соцветия затеняют; примерно так же поступают при заражении колосьев.

Инокулированные ветки плодовых изолируют таким же способом, как и цветки. Если опыты проводят на срезанных побегах, то после нанесения инфекции на листья побеги помещают во влажные камеры, приготовленные из стеклянных колпачков, выстланных изнутри влажной фильтровальной бумагой на 24 часа при оптимальной температуре.

При нанесении заразного начала на листья, стебли и другие органы растений, как правило, применяют суспензию спор (конидий) патогенов. Восковой налет на поверхности листьев затрудняет проникновение грибов, поэтому перед инокуляцией его удаляют, пропуская лист между влажными пальцами. Материал, содержащий инфекцию, как правило, наносят на нижнюю сторону листа в виде капли водной суспензии из пульверизатора или растирают инокулюм по листу скальпелем. Иногда используют сухие споры, которые наносят на увлажненные листья при помощи стерильной кисточки.

При искусственном заражении листьев непосредственно на растениях можно применять малообъемные влажные камеры в виде целлофановых чашечек (диаметром 20 мм), прижатых по краям эластичной пружиной (метод М. С. Дунина).

Инокулированные растения на определенный промежуток времени (12, 24, 48 часов) помещают во влажную камеру для обеспечения более полного заражения. В полевых условиях этого достигают нанесением суспензии спор в пасмурные дни, или под вечер, особенно если ожидается роса.

Инфекционный материал ржавчины хлебных злаков обычно готовят за два часа до нанесения на растения. Для этого берут 200-300 пораженных листьев, погружают их в воду (0,5-1 л) и смывают с них уредоспоры. На 150-200 м² посева расходуют около 20 л суспензии (Л. Ф. Русаков, 1926). В стационарных условиях инокулюм готовят заранее в оранжерее или на специальных посевах. Для заражения делянок — распространителей ржавчины следует брать 5 мг уредоспор на 1 м², распыливая их вместе с тальком в соотношении 1:30 или 1:100. При сплошной инокуляции на 1 м² расходуют 2 мг жизнеспособных уредоспор в случае последующего покрытия растений пленкой и 20 мг — без влажной камеры (К. М. Степанов, 1966).

Искусственное заражение растений базидиоспорами ржавчины (например, линейной или бурой) осуществляют во влажной камере. Берут части растений с развитыми телейтоспорами и помещают их над инокулируемым растением c таким расчетом, чтобы по мере созревания базидиоспоры опадали на его поверхность.

Имеются сообщения о возможности инокулировать возбудителями пирикуляриоза и мучнистой росы отдельные листья злаков, помещаемых во влажные камеры, а также небольшие кружки живых листьев (диаметром 12-14 мм) табака грибом Peronospora tabacinа. При этом их помещают в чашки Петри, дно которых выстлано тремя слоями фильтровальной бумаги, насыщенной без излишка питательным раствором следующего состава (в г на 100 мл воды): тартрат калия и натрия (КОСО—СНОН—СНОН—COONa) — 0,5; К₂НРО₄ — 0,1; KNO₃ — 2,0; Со (N0₃)₂ —0,06; КСl — 0,03; МnO₄ — 0,001 и Mg0₄ —0,5 (Isard, 1960).

При изучении, например, облигатньтх паразитов древесных пород применяют специальные методы. При работе с голосумчатыми грибами, вызывающими деформации плодов и ветвей, для получения аскоспор побеги с признаками поражения, срезанные с больных деревьев, помещают в сосуды с водой, которые закрывают широким стеклянным колпаком. Под край колпака кладут прокладки высотой около 10 см для доступа воздуха. Спустя 1-2 дня на пораженных органах появляется сумчатое спороношение гриба. Образовавшиеся аскоспоры переносят стерильным скальпелем на опытные здоровые растения, на начинающие развиваться завязи или потки. При этом чешуйки принудительно раскрывают, Применяют также и другие специальные методики, исходя из биологии патогенов, целей эксперимента и возможности проникновения инфекции при тех или иных условиях (Гешеле, 1971).

При работе с возбудителем аскохитоза гороха, согласно методике Госкомиссии по сортоиспытанию, инокулюм получают в пробирках на косом агаре. Из одной пробирки культуры гриба приготавливают суспензию взбалтывая ее в 1 л воды. При этом в среднем в одной капле жидкости должно содержаться 40-50 конидий патогена. На 1 м² посева расходуют 2 л суспензии.

Семена можно инокулировать сухим или влажным способом. Заспорение семян практикуют при изучении твердой головни пшеницы. При этом па 1 кг семян расходуют от 1 до 10 г спор в зависимости от ожидаемых условий погоды во время посева и в ближайшие дни, При погоде, не благоприятной для разлития головни, инфекционную нагрузку увеличивают Оптимальными условиями принято считать температуру почвы на глубине залегания семян 6-10°С, Если испытанию подлежат малые партии семян, то их опыливают избыточным количеством спор и пропускают через сито. У семян ячменя и овса для создания необходимой инфекционной нагрузки следует удалять пленки, причем Э. Э. Гешеле (1964) рекомендует удалять только ту часть пленки, которая прикрывает зародыш. В других случаях семена рассыпают тонким слоем на плотной поверхности, опрыскивают суспензией спор, выдерживают во влажной камере. Семена ячменя и овса также успешно инокулируют головней методом погружения в суспензию спор. Для 100 г семян приготовляют 100 см³ суспензии из 4—10 г спор. Семена выдерживают в суспензии 15 мин, три раза тщательно взбалтывая смесь. Затем семена помещают в марлевые мешочки, дают стечь воде и выдерживают 24 ч при 20°С После подсушивания семена высевают.

Заспоренные головней семена овса с удаленными пленками проращивают в ящиках при 25 %-ной влажности почвы и температуре 20°С. После появления всходов их пересаживают в поле. Этот же метод Э. Э. Гешеле (1964) рекомендует применять при искусственном заражении ячменя головней и возбудителем полосатого гельминтоспориоза.

При инокуляции (штамбов) плодовых деревьев на коре через 1-1,5 см наносят два поперечных надреза, между которыми кору разрезают посередине в продольном направлении, отгибая ее створки, делают несколько неглубоких надрезов древесины и вносят культуру изучаемого патогена вместе с куском агаровой среды. Затем створки коры закрывают и место заражения обтягивают полиэтиленовой пленкой или пергаментом, закрепляя края шпагатом или клейкой лентой. При применении бумаги под повязку помещают увлажненный кусок ваты.

В случае заражения скелетных ветвей патогенами, которые могут развиваться только в предварительно ослабленных тканях, последние около места инокуляции прижигают.

При искусственном заражении древесных пород факультативными паразитами (грибы рода Cytospora и др.) опыты лучше проводить в лабораторных условиях на срезанных побегах. Для этого с испытуемого сорта срезают одревесневшие побеги длиной 150 мм и толщиной около 10 мм в количестве 20 шт. (по 10 шт. для опыта и контроля). Затем на расстоянии 50 мм от вершины побега делают вырез глубиной до 5 мм; после поверхностной стерилизации в него помещают агаровую среду с мицелием гриба. Место инокуляции обтягивают полиэтиленовой пленкой, которую по краям закрепляют нитками или изоляционной лентой. С обратной стороны побега под пленку помещают вату, которую при необходимости периодически увлажняют уколом шприца через пленку.

Черенки ставят в стаканы с водой или с предварительно прокаленным влажным песком. Находясь в воде или песке, черенки начинают испытывать недостаток минеральных веществ почвы, их жизненные функции ослабевают и они гибнут. Этот процесс происходит в течение длительного времени что позволяет определить сроки заболевания черенков различной степени ослабления, следовательно, болезнетворную способность гриба и устойчивость растений.

Зараженные побеги сравнивают с контрольными, используя порядковый критерий X обычно в момент гибели 2/3 черенков самого восприимчивого сорта. В случае, когда по краям раны будет проходить усиленное образование каллюса, рану подчищают и проводят вторичную инокуляцию, не прерывая опыта.

Сеянцы древесных пород можно инокулировать путем введения инфекции в стебель при помощи медицинского шприца. Можно вносить инфекционное начало в корни непосредственно в почве, повреждая их металлическим стержнем (споры патогена вводят в образовавшуюся рану).

Инокуляцию плодов и корнеплодов осуществляют нанесением суспензии спор патогена на их стерильную поверхность. При этом можно использовать также сухие споры, прокалывая или надрезая кожицу плода, или вводить водную суспензию спор (1 каплю) шприцем под кожицу. Иногда инфекцию вводят в глубокий вырез корнеплода, вставляя затем вырезанную часть на прежнее место.

Чаще всего инокулюм вносят в почву для создания инфекционного фона без повреждения корневых систем; предварительно гриб размножают на специальных средах.

Для многолетней работы с большим набором видов и сортов растений используют различные инфекционные фоны. Они могут быть естественными и искусственными, а также различаться по степени проявления болезни (слабые, сильные).

При создании инфекционного фона в почве, например возбудителей вилта хлопчатника, сначала выращивают чистые культуры грибов в колбах со стерильными семенами овса (100 зерен на 100 см³ воды). Затем культуры размножают в бутылках со средой того же состава. На каждые 100 м² площади вносят 3-4 кг культуры (ниже описан и другой метод).

Внесение культур грибов в почву используют также при работе с возбудителями увядания (вилта) баклажанов и перца; применяют склероции патогенов в период бутонизации растений с предварительным повреждением корней.

Инокуляцию всходов ячменя и пшеницы возбудителями гельминтоспориоза, фузариоза, офиоболеза и другими патогенами проводят, внося культуру грибов в посевные рядки вместе с семенами. Применяют чистые культуры грибов, выращенных на зернах или агаровых средах (0,5% крахмала, 0,02% КН₂Р0₄, 0,02% Ca(N0₃)₂ 0,02% пептона и 2% агар-агара). Используют также зараженную сечку соломы. Рядки при посеве засыпают зараженной соломой из расчета 20 измельченных растении в смеси с 1 кг перегноя на 25 м посевного рядка (Э. Э. Гешеле, 1964).

При создании инфекционного фона возбудителей снежной плесени в почву вносят смесь штаммов (Fusarium nivale, Typhula incarnata и др.), которые предварительно выращивают на подкисленном картофельном агаре и затем размножают на стерильном овсяном зерне. Перед внесением культуры грибов в почву их смешивают с землей в равных количествах и равномерно распределяют по поверхности участка. Инфекцию вносят в почву осенью из расчета 200 г культуры на овсе на 1 м². Зараженную почву прикрывают сверху слоем земли в 1-1,5 см. Первый год на инфекционном фоне проводят рекогносцировочный посев. Если при этом выпревание растений от патогенов будет равномерным, то на следующий год участок используют для опытов (В. К. Неофитова, Н. А. Новик, 1969).

Инфекционный фон ржавчины льна-долгунца (Меlampsora lini) создают с помощью лыняной соломы, пораженной возбудителем болезни (смесьсортов). Такую солому (стебли) расстилают с осени под снег. Весной пораженные стебли 2-3 часа выдерживают в воде и проверяют всхожесть телейтоспор, проращивая их на 50-100 отрезках стеблей во влажной камере. Подсчет проросших спор проводят через 48 часов после их помещения во влажную камеру.

Первый способ применим при изучении биологии патогена и при инокуляции единичных растений, второй — при полевой оценке сортов.

При создании инфекционного (провокационного) фона для возбудителя вертициллезного вилта хлопчатника на участке в первый год запахивают пораженные грибом растительные остатки (гуза-паю) и обильно поливают почву. На следующий год проводят уравнительный посев восприимчивого к данному заболеванию сорта хлопчатника, после уборки урожая, пораженные растительные остатки снова запахивают. Уравнительный посев необходим также и для того, чтобы проверить надежность провокационного фона. Только после такой проверки его можно считать подготовленным для испытания сортов.

Заражение льна антракнозом (Colletotrichum lini) проводят путем внесения инфекции в почву и опрыскивания всходов споровой суспензией. В качестве инфекционного материала используют пораженную солому льна и всходы, а также чистую культуру патогена, выращенную на овсе и сусло-агаре. Для заражения почвы чистую культуру гриба, больные всходы и солому льна заделывают в верхний слой почвы. Вегетирующие растения инокулируют споровой взвесью в фазе всходов (Т. В. Крылова, Ю. Т. Карпунина, 1969).

При заражении белой гнилью подсолнечника (Sclerotinia libertiana) применяют способ, при котором одновременно с семенами в каждое гнездо вносят с помощью ручной сажалки 2-3 небольших склероция возбудителя болезни. Указанный способ позволяет получить признаки болезни на прикорневой части стебля (А. И. Лукашевич, 1969).

Увеличение запаса инфекции ложной мучнистой росы подсолнечника (Plasmopara helianthi) проводят следующим образом. Сначала приготавливают суспензию зооспор, для чего во влажные камеры помещают пораженные листья и слой влажной фильтровальной бумаги. Влажные камеры выдерживают при температуре 16-20°С. Созревшие конидии снимают с поверхности листьев лезвием бритвы или влажным тампоном и готовят суспензию. Инокуляцию растений осуществляют выдерживанием в суспензии наклюнувшихся семян в течение 5-8 часов при температуре 17-19°С. Затем проростки подсолнечника высаживают в ящики размером 50×40×15 см, парники или открытый грунт. В ящиках и парниках растения размещают по схеме: между рядами 10-15, в ряду 2-3 см; в открытом грунте — между рядами 45-60 и в ряду 3-5 см.

Возбудителя склеротиниоза клевера выращивают из склероциев на ломтиках картофеля во влажной камере. Затем ломтики с развившимся мицелием паразита размещают под растениями у корневой шейки.

Аналогичными способами достигают увеличения количества инфекции в почве путем многократного внесения в нее растительных остатков, зараженных возбудителями ложной мучнистой росы подсолнечника, прикорневой и корневой гнилями пшеницы и ячменя, килы капусты, аскохитоза гороха и др.

Почвенные патогены (грибы родов Verticillium, Fusarium и др.) плодовых и ягодных культур предварительно размножают в чистых культурах на питательной среде. Обычно в качестве питательного субстрата используют зерна злаков, которые заливают водой в колбах (примерно в соотношении 1:1) и стерилизуют в автоклаве при давлении в 1 атм. Затем в колбы с зерном вносят инфекцию соответствующего гриба и выдерживают 10-15 суток с периодическим встряхиванием для перемешивания субстрата. При этом семена голозерных культур (пшеница, рожь, зернобобовые), во избежание образования кашицеобразной массы, смешивают с мякиной или мелконарезанной соломой.

Нормы внесения в почву такой грибной культуры варьируют в зависимости от вида патогена и сорта растений. В качестве придержки можно принять, что следует вносить 3 кг культуры на 120 м² плантации ягодников или 1,5-2 кг на площадь питания одного дерева (в зависимости от схемы посадки).

Таким образом, вышеуказанные методы инокуляции растений весьма разнообразны, с некоторыми изменениями они применимы для работы почти со всеми фитопатогенными грибами на самых различных сельскохозяйственных растениях.